澳门太阳·(中国)集团官方网站-Sunshine Group

澳门太阳集团官网
CRISPR 智库 | 基于 CRISPR/Cas13a 检测赤点石斑神经坏死病毒(RGNNV)
发布时间:2023-11-17 浏览次数:1368
服务科技创新,护航人类健康!www.shbio.com

1700213572755

病毒性神经坏死是一种广泛存在于海洋水产养殖的疾病,主要影响海鱼,并对养殖业造成重大损失。这种疾病是由神经坏死病毒(nervous necrosis virus, NNV)引起的,它是一种分节段的正链 RNA 病毒,属于野田病毒科(Nodaviridae)。NNV 是世界范围内养殖鱼类最重要的威肋之一,近年来受感染的鱼类种类、数量和损害程度都迅速增加。NNVs 直径约 25-30 nm,为二十面体结构,无包膜,基因组由 2 段正链 RNA 组成。RNA1 编码 RNA 依赖性 RNA 聚合酶(RdRp)和非结构蛋白 B,RNA2 编码衣壳蛋白(CP)。

1700213613302

图 1. NNV 结构示意图

NNV 主要感染鱼类的中枢神经系统和视网膜神经系统,可造成 50 多种海洋和淡水硬骨鱼的幼虫和幼鱼种群大量死亡,感染后 1 周内死亡率可达 100%。到目前为止,四种不同的 NNV 物种已经被国际病毒分类委员会正式认定:赤点石斑神经坏死病毒(RGNNV)、拟鲹神经坏死病毒(SJNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(BFNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(TPNNV)。其中 RGNNV 传播最为广泛,感染这种病毒的鱼表现出临床症状,包括有不同程度的神经异常行为(如不正常游动、丧失平衡能力、做螺旋或翻圈泳姿,静止时腹部朝上)和体色变深等。RGNNV 不仅感染石斑鱼,还感染许多其它经济价值较高的海洋鱼类,包括欧洲鲈(Dicentrarchus labrax) 和日本真鲈(Lateolabrax japonicus)。

1700213679024

图 2. NNV 衣壳蛋白系统发育分析

目前,还没有有效治疗这些 NNVs 引起的疾病的方法。不过,如果能及早发现病毒,就可以采取有效措施,减少病毒对健康养殖鱼类的伤害。因此,为了实现可用于及时止损的的养殖场检测策略,建议在水产养殖期间使用分子检测方法定期监测,以确保鱼类不受 RGNNV 感染。因此,开发一种快速、高灵敏度的检测 NNVs 的方法对于疾病预防和控制至关重要。

 

01、基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 检测原理

华南农业大学海洋科学学院王庆课题组开发了一种基于 CRISPR/Cas13a 系统快速检测赤点石斑神经坏死病毒(RGNNV)的方法,该方法具有高灵敏度和高特异性,为 RGNNV 的即时现场检测提供了新方案。

1700213753392

整个检测过程如下,将 Cas13a 和 crRNA 进行共孵育形成 Cas13a/crRNA 复合物,该复合物可以特异性的识别 RGNNV 靶标核酸。当靶标被 crRNA 特异性识别后,Cas13a 的反式切割活性被激活,开始切割 RNA 报告探针,发出检测信号。

1700213822823

图 3. 基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 检测原理

 

02、CRISPR/Cas13a 检测靶标 RNA 的可行性分析

CRISPR/Cas13a 系统依靠 crRNA 和 Cas13a 进行核酸检测,通过增加或减少相关组分来验证该检测系统有效靶向 RGNNV 的可行性。结果表明,只有当检测系统中所有组分都完整时,才会检测到显著的荧光信号。Cas13a 在 crRNA 引导下准确靶向到目标序列后,Cas13a 被激活并反式剪切 RNA 报告探针,发出荧光信号。

1700213906687


图 4. CRISPR 系统检测靶标 RNA 的可行性分析

 

03、CRISPR/Cas13a 检测体系条件优化

将 RNA 标准品和未扩增的样本 RNA 分开检测,测试发现,crRNA-CP 始终比 crRNA-RdRp 具有更高的检测灵敏度。因此,使用 crRNA-CP 进行后续检测。为了评估反应温度对检测系统的影响,测试了 25℃、37℃和 45℃。反应速度随温度升高而增加,45℃组荧光值达到平台仅需 1 分钟,37℃组需 5 分钟,25℃组需 15 分钟以上。37℃组的荧光信号比其他两组更强,因此 37℃为最佳反应温度。接下来,测试了 RNA 报告探针浓度对检测信号的影响,结果表明,探针浓度在 500~700 nM 范围内检测效果最好。最后,发现当 Cas 蛋白与 crRNA 的分子比为 4:1、3:1 时,Cas13a 表现出饱和活性。通过调整分析系统中 Cas 蛋白与 crRNA 的浓度来找到最佳比例。当 Cas13a 的浓度一定时,更多的 crRNA 并没有增加荧光信号。相比之下,当使用 Cas 蛋白与 crRNA 的浓度比例为 1:2 时获得最高的检测信号。Cas 蛋白与 crRNA 的浓度比例为 1:3 时,荧光信号开始减少。这些结果强调了适当的 Cas 蛋白和 crRNA 浓度在检测中的重要性。

1700213985194


图 5. CRISPR/Cas13a 检测体系条件优化

 


04、检测灵敏度评估

  为了测试基于 CRISPR/Cas13a 检测 RGNNV 的灵敏度,将 RGNNV 标准品 RNA 进行梯度稀释,使用新构建的方法进行检测。加入目标 RNA 后,荧光信号发生了显著变化。经过优化的检测系统可以检测到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。检测仪器荧光采集结果显示,当靶 RNA 浓度低于 102 fM 时,测得的荧光信号强度与空白对照无显著差异;当浓度大于 102 fM 时,可以检测到明显的荧光信号。因此,优化后的检测系统可以检测到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。

1700214062035

图 6. 检测 RGNNV 的灵敏度测试

 

05、检测特异性评估

为了评估该检测方法的特异性,使用同一系统检测了 RGNNV、BFNNV 和 TPNNV 这三种病毒。BFNNV 的荧光信号强度与阴性对照没有差异,但 TPNNV 引起了轻微的荧光信号(P<0.0001),突出了该检测系统对其预期靶标 RGNNV 的较高特异性。

1700214143266

图 7. RGNNV 病毒检测系统的特异性

 

 

06、各地区鱼群样本的检测

从国内不同地区收集的感染 RGNNV 的幼鱼样本进行了病毒 RNA 预处理和预扩增,然后与阴性对照进行测试,结果与 qPCR 结果一致(18

1700214209286

图 8. 各地区鱼群样本检测数据

 

总结

本研究建立了一种基于 CRISPR/Cas13a 系统的 RGNNV 快速检测方法。RGNNV 的最佳检测系统包含 120 nM Cas13a、250 nM crRNA 和 600 nM RNA 报告探针,反应体系在 37℃下孵育提高了切割效果。该方法特异性强、灵敏度高、重现性好、准确度高,可以使用便携式紫外灯或荧光检测仪器进行检测,比传统检测方法更具时效性、便捷性和简单性,具有较高的应用推广前景。

 

 

参考文献:

1.Huang F, Shan J, Liang K, et al. A new method to detect red spotted grouper neuro necrosis virus (RGNNV) based on CRISPR/Cas13a[J]. Aquaculture, 2022, 555: 738217.

2.Pascoli F, Guazzo A, Buratin A, et al. Lack of in vivo cross-protection of two different betanodavirus species RGNNV and SJNNV in European sea bass Dicentrachus labrax[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2019, 85: 85-89.

3. 陈文捷,刘晓丹,胡先勤,等。鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势[J]. 水产学报,2014, 38(9): 1666-1672.

 



XML 地图